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循環腫瘤細胞臨床應用的研究進展
來源: | 作者:admin | 發布時間: 2020-07-17 | 1094 次瀏覽 | 分享到:

 循環腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)是指在腫瘤形成和發展過程中,從實體腫瘤病變脫落并進入血流循環的腫瘤細胞。CTC是腫瘤發生發展的直接證據,真實反映了腫瘤負荷和特征,并可以提示療效及預后。既往研究認為CTC的出現即提示腫瘤轉移的發生,然而近期研究在早期腫瘤患者外周血中也發現了CTC的存在,因此CTC也可用于早期診斷。此外,與循環腫瘤DNA/RNA和腫瘤細胞來源外泌體相比,CTC還可進行RNA和蛋白組學的表達譜分析、體外細胞形態和功能研究以及信號共定位展示等,為個體化治療提供了堅實基礎。雖然CTC檢測具有方便、快捷、無創和可重復采樣等優勢,但是外周血中CTC數量非常少(轉移性乳腺癌中每106~108個有核細胞僅有1CTC),通常需要富集之后再進行檢測或分析。以往因受限于提取和富集技術,CTC并未得到進一步研究和應用。直至近十幾年,基于CTC物理特性和分子生物學特征的分離、提取和富集技術的發展,CTC才被應用于臨床,并獲批為腫瘤標志物,在腫瘤的早期診斷及療效和預后評估中凸顯優勢,現就CTC的發展歷史、提取技術及臨床應用研究進展進行闡述。

 

01CTC發展概況

 

1869Thomas Ashworht首次報道了CTCs的存在。之后Stephen Paget等提出了“種子與土壤”假說,認為腫瘤轉移的機制是癌細胞通過血液和淋巴擴散至身體不同地方,從而誘導周圍正常細胞形成“腫瘤微環境”。1998年,CTC首次從血液中分離,并被證實與病理分期相關 。此后,CTC才被應用于臨床。發表在N Engl J Med 的一項前瞻性研究結果提示CTC數目是預測轉移性乳腺癌無進展生存期(progression-free survival,PFS)和總生存期(overall survival,OS)的獨立預后因子。自此CTC被認為是腫瘤轉移的“前兆”,即CTC是腫瘤轉移病灶(血行轉移)形成的“種子”細胞,部分細胞可在循環中存活,并在遠端器官與新的微環境相互作用下形成轉移灶。因此2007年,CTC被美國臨床腫瘤學會(ASCO)納為腫瘤標志物。然而,2010年發表在 J Clin Invest 的研究表明,腫瘤早期也發現CTC的存在?;诖?,2012年病理學年鑒不再認為血液中發現CTC僅提示腫瘤轉移的“前兆”。目前隨著高通量測序技術和單細胞測序技術的出現,CTC全外顯子測序和單細胞測序將有助于更進一步揭示腫瘤異質性和腫瘤演進過程。

 

02CTC分離、富集和檢測技術

CTC的應用與分離技術發展密切相關。第一代CTC分離技術主要依靠CTC物理特征,如基于細胞大小和密度法是通過膜過濾、密度梯度離心等方法進行分離。這一類方法不依賴CTC抗原表達情況,操作方便,但因CTC變形性以及密度差異易導致漏檢,影響分離效果。第二代分離技術是基于CTC表面抗原的表達,利用免疫磁珠進行分選。從本質上講,這種方法可以分為兩大類:基于特定抗原的表達捕獲CTC細胞的陽性選擇和耗盡給定樣品中非CTC的所有細胞的陰性選擇。目前唯一獲得FDA批準的Cell Search系統就是利用表面抗原的表達進行CTC分選。但該方法受上皮標志物表達影響。到目前為止,仍未有公認和普適性的腫瘤表面抗原標志物,原因有以下幾方面:⑴并非所有腫瘤細胞均表達上皮標志物,例如黑色素瘤并不表達上皮標志物。⑵腫瘤細胞入血時會發生上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal translation,EMT),下調上皮標志物表達量,導致磁珠對CTC的吸附能力下降,影響檢出率。⑶在正常情況下,有極少量的正常上皮細胞脫落入血,或者腫瘤患者在進行手術或其他創傷性治療后,上皮細胞可進入血液,導致假陽性的出現。第三代分離技術是利用芯片,包括CTC芯片和微流控芯片等對CTC進行分離、富集。該技術并不是一種獨立的分離技術,而是優化各類技術的一種手段。該技術分離原理多樣,包括基于腫瘤細胞大小、流體力學特性、表面分子標記以及去除白細胞進行陰性富集等。第一代芯片以CTC-Chip為代表,包括Captura公司的GEDI-ChipBiocept公司的OncoCEE微流微柱富集,主要是利用CTC與血細胞生化特性的差異,在芯片中設置微柱陣列將CTC從血液中分離出來。然而,微柱設計比較復雜,難以進行高通量生產。第二類芯片是以HB-Chip為代表,包括GEM-Chip、GO-Chip以及BioFluidica公司的Modular Sinusoidal Microsystem微流表面富集,此類芯片使用抗體包被捕獲CTC,能更高效地捕獲CTC,捕獲效率約為90%,更適合大規模生產。但是,這類芯片所捕獲的CTC被固定在抗體包被的裝置表面,難以進一步分離。雖然胰蛋白酶能將CTC從裝置表面消化并釋放,但是經胰蛋白酶消化釋放的CTC可能失去很多有意義的表面受體。第三代芯片以CTC-iChip為代表,包括Ephesia公司的Ephesia,Cynvenio公司的Liquid BiopsyFluxion公司的Isoflux微流免疫磁珠富集,這類芯片將免疫磁珠和微流控富集技術相結合,捕獲效率與第二代芯片相當。以上芯片均基于CTC化學特性或表面生物標志物進行分離,目前也有基于CTC物理特性進行分選的分離技術,包括基于細胞大小和變形性差異的芯片技術,基于細胞力學性質的芯片技術和基于細胞介電性質的雙向電泳技術等。

CTC檢測主要包括從蛋白、染色體、DNARNA水平實現對腫瘤細胞的定性工作。在蛋白水平,利用免疫熒光標記,如選用CD45-/CK+/DAPI+作為腫瘤細胞定性的標志物,EPISPOT方法可以區分凋亡和有活性的CTC。細胞骨架蛋白對上皮細胞具有特異性,因此細胞角蛋白家族成員(CK8、CK18CK19)也成為檢測上皮表型CTC的標志物。鑒于上皮標志物的局限性,針對干細胞標志物(CD133),間充質標志物(波形蛋白)和腫瘤組織特異性抗原,例如前列腺特異性抗原(PSA)、乳腺特異性抗原乳珠蛋白等也被用于CTC檢測。在染色體水平,熒光原位雜交技術能檢測特定染色體的擴增情況和靶基因的擴增情況;在DNA水平,基因測序和ARMS可以檢測到豐度低至0.1%~1.0%的突變基因;在RNA水平,基因表達圖譜和qPCR技術可檢測CTC基因表達水平。

 

03 CTC對腫瘤早期診斷的作用

 

傳統的影像學檢查難以發現腫瘤早期病灶。當病灶<1 cm時,CTC檢測有可能早于影像學或臨床表現發現腫瘤,從而實現早期診斷。法國巴斯德醫院一項研究納入了168例慢性阻塞性肺?。?/span>chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者、42例吸煙者和35名健康人,研究發現168COPD患者中CTC陽性的5例患者在隨訪的5年內均被診斷為肺癌?;诖隧椦芯拷Y果,LEROY等在法國21個研究中心開展了一項前瞻性、非隨機、多中心、雙盲AIR研究(NCT02500693),以期在肺癌高危人群(吸煙者、COPD患者等)中探討CTC對肺癌發生的預測作用。近年研究還發現具有特定核型或分子標記的CTC在腫瘤早期診斷中發揮了重要作用。一項納入136例新診斷的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者、142例肺部良性疾病患者和32名健康受試者的臨床研究,通過陰性富集技術和FISH技術檢測8號染色體擴增型CTC,發現CTC數量能較好地區分NSCLC及肺部良性疾病患者。CTC8號染色體的計數和非整倍性還在鼻咽癌早期診斷中有一定臨床意義。近期的一項研究在低劑量CT提示肺部結節的患者中,以組織活檢結果作為對照,通過檢測10q22.3/CEP103p22.1/3q29 FISH探針標記的CTC,與組織活檢相比,10q22.3/CEP103p22.1/3q29標記的CTC診斷肺癌的準確性為94.2%,敏感性為89.0%,特異性為100.0%。在乙肝相關肝細胞癌中,干細胞樣CTC對早期肝細胞癌診斷具有較高的敏感性(82.1%)和特異性(94.2%),并且能區分肝癌、乙肝和肝硬化。此外,CTC與其他腫瘤標志物聯合也有助于提高腫瘤早期診斷的準確性。一項納入155例前列腺癌患者的研究發現,PSA、CTC12基因檢測平臺結合后,診斷的準確性達92.7%,CTC還與更高的Gleason評分和高風險相關。CTC與包含CCNE2、DKFZp762E1312、EMP2、MAL2、PPICSLC6A86基因檢測平臺相結合也有助于女性生殖系統腫瘤的早期診斷,聯合診斷宮頸癌的準確率達44%,對子宮內膜癌診斷準確率達64%,對卵巢癌診斷準確率為19%。

雖然CTC最早被認為是腫瘤轉移的早期分子標志,但是隨著CTC在早期腫瘤患者外周血中的發現,越來越多的研究提示CTC不僅對早期腫瘤診斷具有重要的作用,而且與腫瘤分級和TNM分期也具有相關性。

 

04CTC在腫瘤療效和預后評估中的作用

CTC已被認為是一個可靠的預后指標,無論在手術、化療、放療、靶向治療及免疫治療過程中都顯示出了良好的療效和預后評估價值。

在手術治療方面,LI等在可手術切除的NSCLC患者中發現,術前外周血和靜脈血CTC計數是治療失敗時間(time to failure of strategy,TFS)和OS的獨立危險因素,而術中首先離斷流出靜脈可減少腫瘤細胞的播散,改善NSCLC患者的生存結局。也有研究證實術前肺靜脈CTC陽性預示更高的疾病復發風險。一項納入200例胰腺癌患者的前瞻性CLUSTER研究提示,無論是否接受新輔助化療,術前CTC計數與胰腺癌術后復發顯著相關。因此,術前CTC檢測不僅可預測無疾病生存期,也為手術方式和術后治療方案的選擇提供依據。

在化療方面,有研究報道晚期NSCLC患者化療后CTC數量下降與更長的PFS顯著相關,而治療前高CTC計數與更差的病理分期和更高轉移率相關。在乳腺癌中,新輔助治療前CTC陽性被認為是獨立預后因素,結合pCR有助于識別需治療干預的乳腺癌患者。SPARANO等 在Ⅱ~Ⅲ期HER2陰性接受術后輔助治療的乳腺癌患者研究中也發現,CTC與臨床復發率呈正相關。一項納入了430例接受化療的轉移性結直腸癌的前瞻性、多中心臨床研究也證實,治療前和治療過程中的CTC數量是轉移性結直腸癌患者PFSOS的獨立預測因素。動態監測CTC數量變化對療效評估和預測預后具有重要作用。除CTC數量外,在轉移性前列腺癌中,CTC中不同雄激素受體(AR)剪切體也被證實與卡巴他賽療效相關。

在放療方面,迄今最大規模的綜合了來自美國國家癌癥數據庫的1 697例和Ⅲ期SUCCESS研究的1 516例早期乳腺癌患者的研究發現,放療顯著延長了CTC陽性患者的局部無復發生存期(local recurrence-free survival,LRFS)和OS。Ⅲ期隨機CONVERT研究(NCT00433563)則證實了CTC數量預測接受放療局限期小細胞肺癌的療效。PREDICT-HN研究(NCT03491176)提示,在頭頸部腫瘤中,CTC聯合MRI能更好評估放療療效,并為后續放療劑量選擇提供依據。在局部晚期直腸癌中,CTC數量變化和CTC中胸苷酸合酶(TYMS)和切除修復蛋白RAD23同系物BRAD23B)表達變化與接受新輔助同步放化療后的pCR相關,檢測CTC數量和TYMS、RAD23B表達的變化能夠預測局部晚期直腸癌患者對新輔助放化療療效,為下一步治療提供決策。由此可見,CTC不僅能夠預測放療療效,還可能為優化放療人群和放射劑量提供依據。

在靶向治療方面,表達特定靶點CTC的變化能夠預測靶向治療療效。在41例接受培美曲塞聯合厄洛替尼的EGFR突變晚期NSCLC患者中,78%的患者在治療基線的外周血中檢測到CTC,且高水平CTC與不良預后相關;治療過程中,CTC水平下降與療效呈正相關。JIANG等 在232例一線接受EGFR-TKI治療的EGFR突變晚期NSCLC患者中證實,葉酸受體陽性CTC計數可用于動態監測和預測EGFR-TKIs療效和患者預后。PAILLER等通過FISH技術檢測18ALK陽性的NSCLC患者CTC中的ALK重排情況,發現CTC與組織ALK重排具有較高的一致性,認為CTC可作為ALK陽性NSCLC的補充診斷,同時監測ALK抑制劑療效。新近研究還發現CTC可用于探索ALK抑制劑的耐藥機制。CTC不僅代表了腫瘤細胞的生物學和基因組學特性,而且反映了腫瘤的異質性。在納入19ER+/HER2-乳腺癌患者的研究中發現,84%的患者在治療過程中獲得了表達HER2CTC,隨后的功能學實驗發現,HER2+CTC增殖能力更強,且不依賴HER2通路;而HER2-CTCNotch通路和DNA損傷通路被激活。之后也有研究報道HER2+CTC的轉移性HER2陰性乳腺癌患者能從HER2靶向治療中獲益。

在近年來興起的免疫治療中,發現CTC數量和CTC表面PD-L1表達的動態變化與Nivolumab療效相關。然而,也有研究報道在接受Nivolumab治療的Ⅳ期NSCLC中未發現治療前PD-L1+CTC與預后有相關性,但對Nivolumab原發耐藥的患者治療基線時具有更高的PD-L1+CTC數(≥1%)。在頭頸鱗癌中,PD-L1+CTC提示更短的PFSOS。在肝癌、胃癌和胃食管結合部癌中,檢測CTC表面PD-L1的表達也可用于預測PD-1抑制劑SHR-1210的療效。與腫瘤組織中PD-L1表達情況相似,CTCPD-L1表達與免疫檢查點抑制劑療效的關系也仍需進一步探索。除PD-L1外,CTCMART-1、MAGE-A3PAX3表達也被證實與免疫治療療效相關。此外,CTC與免疫細胞活性、血小板等腫瘤微環境檢測相結合,能共同分析腫瘤復發轉移風險,有利于更全面評估預后。

CTC數量外,CTC簇、CTC染色體改變、基因突變和基因表達、細胞分型等也被證實與腫瘤療效和預后相關。CTC簇被認為是乳腺癌轉移的寡克隆前體且能通過改變DNA甲基化,促進乳腺癌轉移。CARTER等探討了CTC拷貝數畸變在預測小細胞肺癌化療耐藥中的作用,發現CTC拷貝數畸變區分化療敏感組或耐藥組的準確率達83.3%,且兩組患者的PFS差異有統計學意義。在結直腸癌CTC中,鳥苷酸交換因子表達升高與較短的PFS呈正相關。在胰腺癌中,不同CTC細胞分型也與預后相關:上皮型CTC的存在與不良預后相關,可作為獨立的預后預測因子,同時上皮型、間質混合型CTC與復發密切相關。在多發性骨髓瘤中,二代測序結果表明CTC和對應的骨髓細胞中的基因表達具有高度一致性,CTCCD44的表達與腫瘤轉移相關。不僅如此,在乳腺癌中,全基因組測序結果提示CTC中信號量4D與乳腺癌腦轉移發生相關 。因此,根據CTC染色體和基因突變以及表達情況對CTC進行分型,確定具有特殊臨床意義(如耐藥、轉移、復發等)的CTC亞型,能夠為后續CTC單細胞研究提供更明確的指導意義。

 

05小結

CTC可作為分析患者腫瘤生物學特征的樣本,目前研究認為CTC有助于及時發現腫瘤的生物學變化,并為及時調整治療方案提供參考,從而實現實時、個體化治療,是目前具有發展潛力的腫瘤無創診斷和實時療效監測手段。與傳統的影像學診斷、內窺鏡檢查以及病理學診斷相比,CTC對發現疾病變化更敏感,能更科學、迅速地評價療效。2019NCCN乳腺癌指南已引入cM0i+)分期,確認CTC在腫瘤分期系統中的重要意義。我國也發表了《循環腫瘤細胞在結直腸癌中的應用專家共識》,明確了CTC在動態評估結直腸癌患者疾病狀態、早期篩查、預后評估及治療反應監測中的重要作用。同時得益于分子生物學和生物信息學的發展,CTC的研究和應用將不僅僅局限于疾病篩查、診斷、療效和預后評估,CTC細胞生物學、分子生物學和基因組學的特征已受到了越來越多的關注。此外,還有研究將CTC進行改造,使其表達TGF-β;或將CTC作為藥物運輸載體,靶向殺傷腫瘤細胞,且發現改造后或攜帶藥物的CTC具有抑制腫瘤效應,但是這些研究仍在臨床前階段,需要更進一步探索。

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